A che cosa serve
Conservazione a temperature ultra-basse con crioprotettori (glicerolo) preserva vitalità per 5+ anni a -20°C, decenni a -80°C. Standard ATCC per banking ceppi.
Quando serve
Backup definitivo di ceppi preziosi, inoculi standardizzati per produzioni ripetibili, conservazione di varianti interessanti scoperte.
- Precisione
- 20% glicerolo finale (v/v) come crioprotettore standard. -20°C minimo, -80°C ottimale.
Che cosa occorre
- Freezer -20°CTemperatura stabile a -18/-20°C
- Pipetta graduataPipette di precisione 1/5/10 ml con propipetta
- Bilancia di precisione 0.01gFondo scala 200-500g, precisione 0.01g, ideale per starter e inoculi piccoli
- Glicerolo puro (>99%)Farmacia o e-commerce laboratorio
- Cryovials sterili 1.5-2ml
- Brodo coltura della specie target
Come si fa
- Prepara stock di glicerolo 50%Glicerolo 50% in acqua distillata, sterilizza in pentola pressione (121°C × 20 min). Conserva sterile a temperatura ambiente.Perché. Glicerolo entra nelle cellule e impedisce formazione cristalli di ghiaccio durante il congelamento — gli stessi cristalli rovinano le membrane.
- Mescola coltura con gliceroloIn cryovial sterile: 800μl coltura attiva (10^9 CFU/ml in fase log) + 200μl glicerolo 50% (concentrazione finale 10%) o 700+300μl per 15%.
- Etichetta accuratamenteSpecie, ceppo, data, fase di crescita, terreno. Etichette resistenti al freddo (Cryo-Babies, etichette specifiche).
- Congela rapidamenteDirettamente a -20°C o -80°C. Per protocolli ATCC: passaggio progressivo -4°C → -20°C → -80°C su 1-2 ore.Perché. Congelamento veloce minimizza cristalli di ghiaccio extracellulari. Lento (overnight in frigo poi freezer) può uccidere il 90% delle cellule.Attenzione. Mai vials senza spazio vuoto — il liquido espande del 9% nel congelamento, può rompere il vetro.
- Riattivazione: scongelamento rapidoEstrai vial, scongelamento a 37°C bagnomaria (1-2 min), inocula immediatamente 100μl in 10ml brodo fresco. Incuba 24-48h. Verifica purezza con streak su agar.
Errori comuni
Cellule troppo vecchie/troppo giovani al congelamento
- Che cosa succede
- Vitalità post-scongelamento <5%
- Come si evita
- Congela cellule in fase log mid (24h dopo inoculo, torbidità media)
Cicli scongelamento-ricongelamento
- Che cosa succede
- Ogni ciclo perde 50%+ vitalità
- Come si evita
- Congela in aliquote singole. Una volta scongelato, mai ricongelare
Sicurezza
- Guanti criogenici per maneggiare vials da -80°C — ustioni da freddo possibili
Il perché, in breve
Glicerolo penetra le cellule e si lega all'acqua intracellulare impedendo formazione cristalli di ghiaccio. A -20°C alcuni microbi sopravvivono 5+ anni con perdita lenta di vitalità (1-2 log/anno). A -80°C la sopravvivenza è quasi indefinita. Protocolli ATCC standard mondiali.
Testo della redazione di Fermentation Lab, lo stesso della Libreria dell'app. Hai trovato un errore? Scrivici: fermentationlabapp@gmail.com