A che cosa serve
Colorazione di Gram (Hans Christian Gram, 1884) distingue Gram+ (viola) da Gram- (rosa) per spessore parete cellulare. Fondamentale per identificare famiglie microbiche.
Quando serve
Identificare morfologia contaminanti, verificare purezza colture, distinguere lattobacilli (Gram+) da enterobatteri (Gram-).
- Precisione
- Identificazione Gram+/- 95%+ con procedura corretta. Classificazione macro-famigliare ma non specie.
Che cosa occorre
- Microscopio otticoObiettivi 10×, 40×, 100× (immersione)
- Vetrini portaoggetto e coprioggetto
- Becco Bunsen ad alcool
- Cristal violetto 1%e-commerce laboratorio
- Iodio di Gram (lugol)e-commerce laboratorio o farmacia
- Alcol-acetone 95%farmacia
- Safranina 0.25%e-commerce laboratorio
Come si fa
- Smear battericoGoccia acqua sterile su vetrino. Ansa sterile, piccola quantità di colonia, disperdi nell'acqua. Asciuga all'aria 5 min.
- Fissa al calore3 passaggi attraverso fiamma Bunsen, lato batterico in alto. Fissa al vetro senza distruggere.Perché. Non scaldare troppo. Caldo ma toccabile. Fissaggio eccessivo distorce morfologie.
- Cristal violetto 60sCopri smear 1 min. Risciacqua delicatamente con acqua distillata.
- Iodio di Gram 60sCopri con iodio (lugol) 1 min. Risciacqua con acqua distillata.Perché. Iodio forma complesso insolubile con cristal violetto, intrappola colorante in Gram+.
- Decolorazione con alcol (FASE CRITICA)Inclina vetrino, lascia scorrere alcol-acetone fino a liquido di scolo chiaro (5-15s). Risciacqua IMMEDIATAMENTE.Perché. Gram+ = peptidoglicano spesso che trattiene complesso. Gram- = parete sottile + membrana esterna; alcol disgrega membrana.Attenzione. Fase più delicata. Troppo decolorazione → Gram+ come Gram-. Troppo poca → Gram- come Gram+.
- Safranina 30-60sCopri 30-60s. Controcolorante che colora di rosa Gram-.
- Osserva al microscopio 1000×Asciuga delicatamente, olio immersione obiettivo 100×. Gram+ viola, Gram- rosa.Perché. Lactobacillus = Gram+ (viola, bastoncelli). E. coli = Gram- (rosa, bastoncelli). Staphylococcus = Gram+ (viola, cocchi a grappoli).
Errori comuni
Sovra-decolorazione
- Che cosa succede
- Gram+ classificati come Gram-
- Come si evita
- Cronometra esatto, interrompi appena scolo chiaro
Smear troppo denso
- Che cosa succede
- Accumuli che trattengono colore, identificazione impossibile
- Come si evita
- Diluisci campione, smear sottili
Sicurezza
- Cristal violetto macchia pelle/abiti — guanti
- Alcol-acetone infiammabile — lontano da fiamma
Il perché, in breve
Parete Gram+ = 30-100 strati peptidoglicano (20-80nm). Gram- = 1-2 strati (5-10nm) + membrana esterna LPS. Alcol dissolve lipidi membrana esterna Gram-, fa sfuggire cristal violetto. In Gram+ parete spessa trattiene colorante anche dopo alcol.
Testo della redazione di Fermentation Lab, lo stesso della Libreria dell'app. Hai trovato un errore? Scrivici: fermentationlabapp@gmail.com